前言
本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。
本标准与GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下：
——修改了标准的中英文名称；
——"第二法 大肠菌群平板计数法"的平板菌落数的选择范围修改为"15 CFU～150 CFU"；
——删除了"第三法 大肠菌群Petrifilm TM测试片法"。
本标准的附录A、附录B为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1 大肠菌群 coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数 most probable number，MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量 0.1 g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。
3.9 无菌培养皿：直径 90 mm。
3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
3.11 菌落计数器。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。
4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录 A 中 A.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录 A 中 A.3。
4.4 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.4。
4.5 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.5。
4.6 无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.6。
4.7 无菌 1 mol/L HCl：见附录 A 中 A.7。
第一法 大肠菌群 MPN 计数法
5 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
6.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。
6.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续 培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的 MPN值。
第二法 大肠菌群平板计数法
7 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠菌群平板计数法检验程序
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
按6.1进行。
8.2 平板计数
8.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
8.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
8.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。
8.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃ 培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g （mL）样品中大肠菌群数。例：10-4 样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。
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